Mejoramiento de un método no comercial para la extracción de ADN de moscas de interés médico-legal

La obtención de ADN de moscas de interés médico-legal es de relevancia para una variedad de aplicaciones. Aunque existen métodos de extracción comerciales de ADN, su uso rutinario es limitado, en algunos escenarios. En este contexto, el uso de métodos no comerciales constituye una alternativa; sin embargo, su optimización es clave para mejorar el flujo de trabajo y los resultados. Este trabajo evaluó el impacto de variaciones a un método de precipitación salina sobre la concentración y la pureza del ADN recuperado. No se encontraron diferencias significativas en la concentración de ADN extraído entre los diferentes tiempos de incubación, probados durante la fase de extracción, mientras que el incremento en el volumen de etanol absoluto, en la fase de precipitación de ADN, mejoró significativamente la concentración de ADN obtenido. Las modificaciones propuestas reducen el tiempo de ejecución y la concentración de ADN obtenido comparado con el protocolo original.

Obtaining DNA from flies of medico-legal interest is relevant for a variety of applications. Although commercial extraction methods offer optimal DNA, their routine use is limited in some settings. In this context, the use of non-commercial methods constitutes an alternative in laboratories with limited resources however, its optimization is key to improving the workflow and the results. This work evaluated the impact of variations to a saline precipitation method on the concentration and purity of the recovered DNA. No significant differences were found in the concentration of extracted DNA between the different incubation times tested during the extraction phase. In contrast, the increased volume of absolute ethanol in the DNA precipitation phase significantly improved the concentration of DNA obtained. The proposed modifications reduce the runtime and DNA concentration obtained compared with the original protocol.

Storage and purification adaptations for the isolation of total RNA from the dura mater / Adaptações no armazenamento e purificação para o isolamento de RNA total da dura-máter

Abstract Background RNA extraction is a step that precedes several molecular techniques. The fibrous tissue, more specifically the dura mater, has several limitations in routine protocols, and lacks optimization protocols to overcome these problems. Objective To test stock reagents and purification kits, optimizing commercial kit protocols for RNA extraction from the dura mater. Methods Dura mater samples were obtained from eight Wistar rats and maintained in two different stabilizers. The samples were purified using four different protocols, and the RNA was evaluated for the yield and purity in NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States). Beta-actin gene was used for analyzing gene expression, since is one of the most used reference genes. Results The RNA preservation was similar in both stabilizers. The addition of an incubation step prior the purification protocols allowed better tissue digestion and RNA recovery. The RNA purified using the protocols membrane-based showed higher quality than liquid-liquid purification. This impact was observed in the 3-week evaluation using RT-qPCR. Conclusion Stabilizers are efficient for RNA preservation and membrane-based purification protocols are more suitable for RNA recovery from dura mater tissue, allowing the evaluation of gene expression in this type of tissue. Adaptations in the dura mater RNA extraction protocol differ from the pre-established protocols because it takes into account the peculiarity of fibrous tissue and low cellularity. In addition to providing a low-cost mechanism, based on techniques that are part of the laboratory routine, it is possible to improve the quality of the extracted material, ensuring greater efficiency in the use of subsequent techniques.

Resumo Antecedentes A extração de RNA é uma etapa que antecede várias técnicas moleculares. O tecido fibroso, mais especificamente a dura-máter, apresenta várias limitações nos protocolos de rotina e carece de protocolos de otimização para superar estes problemas. Objetivo Testar reagentes de estoque e kits de purificação, otimizando protocolos de kits comerciais para extração de RNA da dura-máter. Métodos Amostras de dura-máter foram obtidas de oito ratos Wistar e mantidas em dois estabilizadores diferentes. As amostras foram purificadas em quatro protocolos diferentes e o RNA foi avaliado quanto ao rendimento e pureza no NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States). O gene da beta-actina foi utilizado para analisar a expressão gênica, uma vez que é um dos genes de referência mais utilizados. Resultados A preservação do RNA foi semelhante em ambos os estabilizadores. A adição de uma etapa de incubação antes dos protocolos de purificação permitiu uma melhor digestão do tecido e recuperação de RNA. O RNA purificado pelos protocolos baseados em membrana apresentou qualidade superior ao da purificação líquido-líquido. Este impacto foi observado na avaliação de três semanas usando RT-qPCR. Conclusão Os estabilizadores são eficientes para preservação do RNA e os protocolos de purificação baseados em membrana são mais adequados para recuperação de RNA do tecido da dura-máter, permitindo a avaliação da expressão gênica neste tipo de tecido. As adaptações no protocolo de extração de RNA da dura-máter diferem dos protocolos preestabelecidos porque leva em consideração a peculiaridade do tecido fibroso e com baixa celularidade. Além de fornecer um mecanismo de baixo custo, baseado em técnicas que fazem parte da rotina laboratorial, é possível melhorar a qualidade do material extraído, garantindo maior eficácia no uso de técnicas subsequentes.

Uso de genomas de SARS-CoV -2 para la estimación del número reproductivo efectivo (Rt) en Perú durante marzo y abril del 2020

La comprensión de la COVID-19, provocada por el coronavirus de tipo 2 (SARS-CoV-2) causante de síndrome respiratorio agudo severo, utilizando un enfoque multidisciplinario, es esencial para mejorar la toma de decisiones basadas en evidencia. Se estimó el número reproductivo efectivo (Rt) en Perú a partir de 113 genomas completos generados por el Instituto Nacional de Salud (INS) del Perú almacenados en la base de datos pública GISAID. La tendencia mostrada por el Rt durante marzo y abril del 2020 fue similar a otras estimaciones epidemiológicas. El Rt disminuyó considerablemente durante la primera quincena de marzo, alcanzando su menor valor la semana posterior al inicio de la cuarentena, pero aumentó moderadamente desde la quincena de abril. Se discute las implicancias de las medidas tempranas tomadas para mitigar la transmisión. La vigilancia genómica será una herramienta necesaria para conocer la transmisión y evolución del virus, y complementará la información epidemiológica.

The understanding of COVID-19, caused by the SARS-CoV-2, is essential to improve evidence-based public health policies. The effective reproductive number (Rt) in Peru was estimated using information from 113 complete genomes sequenced by the Instituto Nacional de Salud del Perú (INS), available in the GISAID public database. The Rt trend during March and April of 2020 was found to be similar to results from other epidemiological reports. The Rt decreased during the first two weeks of March. Its lowest value was reported during the week after the quarantine began. The Rt increased moderately after the second week of April. The implication of early decisions taken to mitigate the transmission are discussed. Genomic surveillance will be necessary to understand the transmission and evolution of SARS-CoV-2 in Peru, and will complement the epidemiological information.

La biopsia líquida en el diagnóstico y monitoreo de pacientes oncológicos: Oportunidades y retos en Latinoamérica / Liquid biopsy in the diagnosis and monitoring of cancer patients: opportunities and challenges in Latin America

Resumen En los últimos años el estudio de los ácidos nucleicos circulantes ha tenido grandes avances en el campo de la oncología, lo que ha permitido avanzar de forma importante en las aplicaciones clínicas de la biopsia líquida en diferentes áreas como el pronóstico, la estadificación, la predicción de recurrencia, la selección y monitorización de tratamientos, entre otros. Lo anterior se debe en gran parte al desarrollo de nuevas y mejores tecnologías, algunas de las cuales incluso han sido autorizadas para el diagnóstico y seguimiento clínico de ciertos tipos de cáncer. No obstante, la utilización de la biopsia líquida como herramienta de apoyo clínico sigue siendo objeto de estudio. Debido a la importancia que ha cobrado este avance tecnológico a nivel mundial, se realizó una revisión de literatura con el fin de establecer el estado actual del uso de biopsia líquida en oncología, así como sus aplicaciones clínicas actuales, con un énfasis en Latinoamérica.

Abstract In recent years, the study of circulating nucleic acids has made great progress in the field of oncology, allowing for significant advances in clinical applications of liquid biopsy in diverse areas such as prognosis, staging, recurrence prediction, selection and monitoring of treatments, among others. This advance is largely due to the development of new and better technologies, some of which have even been validated for the diagnosis and clinical follow-up of certain types of cancer. However, the use of liquid biopsy as an additional tool in clinical oncology remains under study. Given the worldwide importance of this technological advance, a literature review was conducted to establish the current status of the use of liquid biopsy in oncology, as well as its current clinical applications, with a particular focus on Latin America.

Vacunas para SARS-CoV-2: diferentes estrategias de los desarrollos en curso / Vaccines for SARS-CoV-2: different strategies of ongoing developments

El objetivo de este artículo es proporcionar una guía que sirva para la interpretación y seguimiento de los esfuerzos que se están desarrollando en todo el mundo con el objetivo de obtener una vacuna que pueda generar inmunidad contra el nuevo coronavirus SARS-CoV-2 de 2019, el agente causante de la enfermedad por coronavirus denominada COVID-19. Cinco meses después de haber sido detectada la enfermedad, ya hay 102 vacunas en distintos estadios de desarrollo, registradas por la Organización Mundial de la Salud (OMS), correspondientes a 8 plataformas vacunales con diferentes estrategias, y todos los días aparecen nuevas. Esto representará un enorme desafío de organismos internacionales, para la evaluación, comparación y selección de aquellas que cumplan con los criterios regulatorios indispensables de seguridad y eficacia y que, por otro lado, puedan ser producidas en cantidades suficientes para abastecer la demanda mundial. (AU)

The objective of this article is to provide a guide to help the interpretation and monitoring the efforts that are being carried out worldwide to obtain a vaccine that will be able to generate immunity against the new 2019 SARS-CoV-2 coronavirus, the viral agent causes the disease named COVID-19. Five months after the disease was detected, there are already 102 vaccines at different stages of development, registered by World Health Organization (WHO), corresponding to 8 vaccination platforms base on different strategies, and every day new ones appear. This will represent a huge challenge for international organizations, to evaluate, compare and selects those that will meet the essential regulatory criteria of safety and efficacy and that, would be able to be produced in enough quantities to supply the worldwide demand. Key words: SARS-Cov-2 vaccine, vaccine platform, COVID-19 strategy, attenuated virus, viral vector, viral proteins, viral DNA, viral RNA, nucleic acids, viral like particles, WHO. (AU)

Detección molecular del gen de la glicoproteína B del virus herpes felino / Molecular detection of glycoprotein B from feline herpesvirus

El virus herpes felino tipo 1 genera múltiples problemas y el gato termina con consecuencias que afectan su futura calidad de vida. Este virus está distribuido en todo el mundo y es de fácil transmisión y dado que es un patógeno latente, continúa propagándose sin control a toda la población de gatos. El diagnóstico se basa en los signos clínicos, existiendo hoy en Chile solo un método de diagnóstico de laboratorio específico, implementado para identificar el agente, que no se usa regularmente en la clínica de animales pequeños. Así, el tratamiento y diagnóstico generalmente se basan en el conocimiento y la experiencia del médico veterinario, sin dejar una confirmación real sobre qué agente está causando los síntomas. Esta investigación propuso un método de diagnóstico molecular alternativo a la detección del gen de la timidina quinasa viral, para el cual se seleccionaron gatos menores de 1 año de edad, con síntomas compatibles con una infección con el virus del herpes felino. El método de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) se utilizó para detectar el gen de la glicoproteína B del virus herpes felino tipo 1, seguido de la determinación del porcentaje de identidad de nucleótidos (PIN) respecto a los datos oficiales del GenBank®. De los 11 gatos estudiados, en solo uno de ellos se pudo amplificar un segmento que correspondía al gen de la glucoproteína B. El PIN resultante (>96 por ciento) confirma que la secuencia obtenida corresponde al gen de la glicoproteína B tipo 1 del virus del herpes felino y se discute la eficiencia del método implementado(AU)

The feline herpesvirus type 1, generates multiple problems and the cat ends with consequences that affect its future quality of life. This virus is distributed throughout the world and is easily transmitted and since it is a latent pathogen, it continues to spread uncontrollably to the entire cat population. The diagnosis is based on clinical signs, today there is only a specific laboratory diagnostic method implemented in Chile to identify the agent, which is not used regularly in the clinic of small animals. Thus, the treatment and diagnosis are usually based on the knowledge and experience of veterinarian without leaving a real confirmation about which agent is causing the symptoms. This research proposed a molecular diagnostic method alternative to timidine kinase detection gene, for which cats under 1 year of age were selected, with symptoms compatible with an infection with the feline herpesvirus. The Polymerase Chain Reaction (PCR) method was used to detect the feline herpesvirus type 1 glycoprotein B gene, followed by the determination of the percentage of nucleotide identity (NIP) from official GenBank® data. Of the 11 cats studied, only one of them resulted in the amplification of a segment corresponding to the glycoprotein B gene. The resulting NIP (> 96 percent) confirms that the sequence obtained corresponds to type 1 glycoprotein B gene of feline herpesvirus and the efficiency of the method implemented is discussed(AU)

Epigenética de la enfermedad renal / Epigenetics of Renal Disease

Para nosotros generar una defnición determinada y entendible necesitamos de elementos de comparación; así, por ejemplo, para nosotros "entender "que es el "día" necesariamente debemos conocer que es la "noche". Esta antítesis por contraste nos grafca estos dos conceptos y nos lleva al ámbito de la "certidumbre" y es por esto que un "eclipse total" en pleno día se presenta como un fenómeno de ruptura de lo conocido como "cierto" desde que nacemos y que NO admite contradicción pues es ya parte de nuestra "conciencia genética" ; es decir, un evento externo de la vida real (día-noche) condicionado a eventos internos (genéticos) generando ­ en el caso del ejemplo ­ el "ritmo circadiano", "envejecimiento celular", "esperanza de vida al nacer" , "cronobiología".

For us to generate a definition determined and understandable we need elements of comparison; Thus, for example, for us to "understand" what "day" is, we must necessarily know what is the "night". This contrast antithesis we graph these two concepts and we leads to the field of "certainty" and this is why a "total eclipse" in broad daylight it is presented as a phenomenon of rupture of the known as "true" since we were born and that does NOT admit contradiction it is already part of our "genetic consciousness"; that is, an event external real life (day-night) conditioned to internal events (genetic) generating - in the case from the example - the "circadian rhythm", "Cell aging", "hope of life at birth "," chronobiology ".

ADN, disco duro de la vida / DNA, life's hard drive

A lo largo de los últimos dos siglos la medicina se vio nutrida con los descubrimientos bioquímicos que impulsaron el entendimiento de los mecanismos isiopatológicos y facilitó el desarrollo de la terapéutica. En cambio, en el presente siglo entramos a la era de la genómica y del "big data", por lo que el estudio de las funciones del ADN como dispositivo de almacenamiento de información es esencial para la comprensión de la nueva medicina genómica personalizada, de precisión. En la presente revisión, se analiza el ADN como un dispositivo informático con tres funciones: almacenamiento, expresión y transmisión de la información acumulada a lo largo de la ilogenia en forma de secuencias de nucleótidos. Se describe cada una de estas funciones comparándolas con la información manejada por una computadora o una sociedad, y se brindan ejemplos de patologías que surgen ante el fallo de alguna de las funciones. La revisión bibliográica es amplia e incluye los artículos más relevantes, tanto históricos como del estado del arte, correspondientes a cada tema...(AU)

A incorporação do teste diagnóstico baseado na amplificação de ácidos nucleicos (NAT) para triagem de sangue no SUS: arranjos tecnológicos para a nacionalização do "NAT brasileiro" / The introduction of nucleic acid tests (NAT) for blood screening in the Brazilian public healthcare system: technological arrangements for the nationalization of the "Brazilian NAT"

Resumo Os testes de ácidos nucleicos (NAT) são ferramentas complementares aos testes sorológicos para controle da transmissão de doenças infecciosas por meio de produtos obtidos a partir do sangue. Em 2002, um decreto do Ministério da Saúde tornou obrigatória a realização do NAT por todos os bancos de sangue, medida dificultada por razões como os custos necessários para a sua implantação. Como estratégia para a sua incorporação nos bancos de sangue ligados ao SUS, um consórcio público foi criado para desenvolver uma versão local do kit. A partir de métodos de pesquisa qualitativa, os autores analisam essa iniciativa, visando esmiuçar os detalhes da "nacionalização tecnológica" de um teste diagnóstico in vitro. O artigo descreve como o consórcio compreende o kit e como cada uma das tecnologias que o compõem são obtidas e reunidas no teste brasileiro. A relevância dessa análise é identificar quais os desafios e os limites à produção de testes in vitro para doenças infecciosas no Brasil, assim como a repercussão desse tipo de iniciativa para o sistema nacional de inovação em saúde.

Abstract Nucleic acid based amplification tests (NAT) are employed as complementary tools to control the transmission of infectious diseases through contaminated blood. In 2002, a decree from the Brazilian Ministry of Health made compulsory the use of NAT by all the blood services in the country, a measure that was challenged by costs related to the test incorporation. As the strategy to introduce the test in the blood banks serving the public healthcare system (Sistema Único de Saúde), a public Consortium was constituted to develop a local version of the kit. On the basis of qualitative fieldwork, the authors investigate the strategies used by the Brazilian laboratories and universities to nationalize the kit through capturing and assembling its various components. The paper contributes to revealing the challenges and limits to the production of in vitro tests for infectious diseases in Brazil, as well as the repercussion of such an initiative to the national healthcare innovation system.

In vitro digestibility of specific dsRNA by enzymes of digestive tract of shrimp Litopenaeus vannamei / Digestibilidad in vitro del dsRNA específico por enzimas del tracto digestivo del camarón Litopenaeus vannamei

ABSTRACT Objective. The digestibility of specific dsRNA by action of the enzymes of digestive tract of the whiteleg shrimp Litopenaeus vannamei was determined in vitro. Materials and methods. Digestive enzyme activity (amylase, lipase, protease, DNase and RNase) was measured in the stomach, digestive gland, and anterior, middle, and posterior intestine of juvenile shrimp, and the digestibility of DNA, RNA and the dsRNA-ORF89, specific to WSSV, was determined by in vitro assays, as well as electrophoretic and densitometric analyses. Results. The highest enzymatic activity was found in the digestive gland: amylase (81.41%), lipase (92.60%), protease (78.20%), DNase (90.85%), and RNase (93.14%). The highest digestive capacity against DNA, RNA, and dsRNA was found in the digestive gland (5.11 ng of DNA ​​per minute, 8.55 ng of RNA per minute, and 1.48 ng dsRNA per minute). Conclusions. The highest digestibility of dsRNA-ORF89, specific to WSSV, was found in the digestive gland, whereas the lowest digestibility was observed in the posterior intestine. This is the first report regarding the digestibility of dsRNA-ORF89 by whiteleg shrimp digestive tract enzymes, with potential therapeutic importance in shrimp culture to prevent WSSV disease through balanced feed.

RESUMEN Objetivo. La digestibilidad del dsRNA específico para el virus de la mancha blanca (WSSV) por acción de las enzimas del tracto digestivo del camarón Litopenaeus vannamei fue analizada in vitro. Materiales y métodos. Se midió la actividad de enzimas digestivas (proteasa, amilasa, lipasa, ADNasa y ARNasa) en el estómago, la glándula digestiva, el intestino anterior, medio y posterior en juveniles de camarón patiblanco y se evaluó la digestibilidad de ácidos nucleicos ADN, ARN y dsRNA-ORF89 especifico contra el virus WSSV, por análisis electroforéticos y densitometría. Resultados. La actividad enzimática más alta se encontró en la glándula digestiva del camarón: amilasa (81.41%), lipasa (92.60%), proteasa (78.20%), ADNasa (90.85%) y ARNasa (93.14%). Se evidenció la capacidad digestiva del camarón patiblanco contra el ADN, ARN y dsRNA-ORF89 encontrando en la glándula digestiva la mayor digestión (5.11 ng de ADN por minuto, 8.55 ng de ARN por minuto y 1.48 ng de dsRNA por minuto). Conclusiones. La mayor digestibilidad del dsRNA-ORF89, específico contra el virus WSSV, se encontró en la glándula digestiva y la menor en el intestino posterior. Este es el primer informe relacionado con la digestibilidad del dsRNA-ORF89 por las enzimas del camarón patiblanco con potencial importancia terapéutica en el cultivo de camarón para prevenir la enfermedad del WSSV a través del alimento balanceado.

Preservación de biopsias obtenidas por colonoscopia en pacientes con cáncer colorrectal para análisis moleculares / Preservation of obtained biopsies by colonoscopy in patients with colorectal cancer for molecular analysis

Introducción: los estudios relacionados con el análisis del ADN han marcado una pauta para los avances en las ciencias básicas y uno de los requisitos para la obtención de buenos resultados es la calidad del material genético extraído, en conjunto con el método empleado para la preservación de las muestras. Objetivo: comparar tres métodos de preservación de biopsias obtenidas por colonoscopia en pacientes con cáncer colorrectal con fines de uso en estudios de biología molecular. Materiales y métodos: se tomaron biopsias por colonoscopia a nueve pacientes con diagnóstico clínico de cáncer de colon, las cuales se preservaron en solución salina y dos solventes estabilizadores de ácidos nucleicos, RNAlater® y LifeGuard™ Soil Preservation Solution; se realizó extracción del ADN total a las nueve muestras y se verificó la concentración y la calidad del ADN extraído. Resultados: la extracción del ADN a las 24 horas, ocho días, quince días, un mes, seis meses, uno y dos años después de la toma de la muestra, mostró que el ADN de las biopsias preservadas en solución salina se presentaba con baja concentración y degradado a los ocho días, mientras que el preservado en soluciones comerciales estabilizadoras presentó una buena calidad y alta concentración. Por otro lado, la calidad del ADN fue verificada mediante la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de un fragmento de ADN asociado al gen APC. Conclusiones: las soluciones LifeGuard™ y RNAlater® pueden ser usadas durante el transporte y conservación de tejidos humanos, y pueden ser recomendados para aquellos laboratorios que deseen preservar muestras con métodos diferentes al embebido de muestras en parafina o que no cuentan con métodos de conservación altamente eficientes como la criogénesis. (AU)

Introduction: Studies related to DNA analysis have set a standard for development in the basic sciences, and one of the requirements for obtaining good results is the quality of the genetic material extracted, together with the method used for the samples preservation. Objective: To compare three methods of preserving biopsies obtained by colonoscopy in patients with colorectal cancer, for purposes of use in molecular biology studies. Materials and methods: Biopsies by colonoscopy from nine patients with clinical diagnosis of colon cancer were taken and preserved in saline solution and two nucleic acids stabilizing solvents, RNAlater® y LifeGuard™ Soil Preservation Solution. The extraction of total DNA was carried out to the nine samples and the concentration and quality of the extracted DNA was verified. Results: DNA extraction at 24 hours, eight days, 15 days, one month, six months, one year and two years after sampling showed that the DNA from biopsies preserved in saline solution had low concentration and degraded at eight days. DNA from samples preserved in commercial stabilizing solutions had high concentration and good quality. This last one was verified by amplification of a DNA fragment associated to the APC gene by polymerase chain reaction. Conclusions: The LifeGuard™ solution as well as the RNAlater® can be used in transport and conservation of human tissues, and may be recommended for laboratories wishing to preserve specimens with different methods to paraffin-embedded specimen or that do not have highly efficient conservation methods such as cryogenics. (AU)

Infecciones de transmisión sexual silentes: la muestra de orina permite una adecuada detección / Non symptomatic sexually transmitted infections: urine sample allows an adequate detection

Detection of non-symptomatic sexually transmitted infections (NSSTD) has taken great relevance, primarily due to global increase. This has led to implement various laboratory techniques with the aim of early detection of these silent infections to decrease the incidence. Techniques usually used for the detection and identification of NSSTD require invasive samples (blood, citobrush, etc.), so the urine could be a simpler option and noninvasive sample when the patient be subjected to test for some of these infections.

La detección de infecciones de transmisión sexual silentes (ITSS) ha tomado gran relevancia, debido principalmente a su incremento en el mundo. Esto ha llevado a implementar diversas técnicas de laboratorio con la finalidad de la detección precoz de estas infecciones silentes para disminuir su incidencia. Las técnicas que habitualmente se utilizan para la detección e identificación de ITSS requieren de una muestra invasora (sangre, citobrush, entre otras), por lo que la orina podria ser una opción de muestra más simple y no invasora al momento que el paciente se deba someter a un examen para detectar alguna de estas infecciones.

Seleção de aptâmeros que se ligam ao receptor humano para o gosto doce / Screening for aptamers that bind to the human sweet taste receptor (hT1R2/hT1R3)

Foi demonstrado que o gosto doce é transduzido por receptores acoplados a proteína G classe III (GPCRs), T1R2 e T1R3. Essas proteínas exibem longas extremidades amino-terminais que formam um domínio de ligação globular extracelular. Elas são expressas em células associadas ao gosto (células epiteliais que constituem os botões gustativos nas papilas gustativas), que respondem a moléculas associadas ao gosto doce. Quando T1R2 e T1R3 são co-expressas em células heterólogas, elas respondem, como heterômeros, a uma série de açúcares, alguns D-aminoácidos, edulcorantes artificiais e proteínas doces. Foi também demonstrado que o receptor humano T1R2/T1R3 para o gosto doce apresenta múltiplos sítios de ligação. Para melhor compreender a estrutura desse receptor e responder à pergunta de como um único quimiorreceptor pode ser responsivo a uma variedade de ligantes, foi utilizada a abordagem denominada evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) para isolar, a partir de uma biblioteca combinatória de oligonucleotídeos, aptâmeros de RNA resistentes a nuclease que se ligam ao receptor humano para o gosto doce com alta afinidade. Após um enriquecimento de doze ciclos do pool original de RNA contendo em torno de 1013 sequências diferentes (contra preparações de membrana de células HEK293T que expressam hT1R2/hT1R3) e outros ciclos de contrasseleção negativa (para eliminar moléculas de RNA que se ligam de forma inespecífica à membrana de nitrocelulose e a outras proteínas diferentes do alvo, ou seja, proteínas de membrana de células HEK293T selvagem), realizou-se a transcrição reversa do RNA seguida de amplificação por PCR e sequenciamento. Aptâmeros do ciclo 12 com sequências consenso foram selecionados, e a ligação de alguns deles com hT1R2/hT1R3 foi então avaliada. Cinco desses aptâmeros mostram claramente uma maior afinidade por células HEK293T que expressam hT1R2/hT1R3. Como segunda parte desta tese, estudamos outro receptor, denominado CD36, que, como o receptor T1R2/T1R3, é expresso na língua. Estudos indicam que ele age como receptor gustativo de gordura. Neste trabalho, verificamos que essa proteína é expressa em uma subpopulação de neurônios olfatórios presentes no epitélio olfatório, indicando que ela pode ter também uma função olfatória, ainda não caracterizada

It has been shown that sweet taste is transduced by the Class III G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) T1R2 and T1R3, which show long N-termini that form a globular extracellular ligand-binding domain. These receptors are expressed in the taste cells (epithelial cells that constitute the taste buds in taste papillae) that respond to sweet tastants, and when T1R2 and T1R3 are coexpressed in heterologous cells, they respond, as heteromers, to a series of sugars, some D-amino acids, artificial sweeteners and sweet proteins. It has also been demonstrated that the sweet taste receptor has multiple binding sites. In order to better understand the structure of this receptor and answer the question of how a single chemoreceptor can respond to a variety of ligands, we used the combinatorial oligonucleotide library screening approach, denominated Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX), to isolate nuclease-resistant RNA aptamers that bind to the human sweet taste receptor with high affinity. Following a twelve round enrichment of the previous random RNA pool containing around 1013 different sequences (against membrane preparations of hT1R2/hT1R3-expressing HEK293T cells) and negative counterselection cycles (to eliminate RNA molecules that bind nonspecifically to the nitrocellulose membrane and to proteins other than the target, that is, HEK293T cells membrane proteins), the RNA was reverse-transcribed for DNA sequencing. Aptamers from cycle 12 with consensus sequences were selected, and the binding of some of them to the human sweet taste receptor was then evaluated. Five out of the aptamers clearly show greater affinity for hT1R2/hT1R3-expressing HEK293T cells than for hT1R2/hT1R3-non-expressing HEK293T cells. In this thesis we have also analyzed another receptor, denominated CD36, which is also expressed in the tongue. Studies indicate that it acts as a receptor for fat. In this work, we found that CD36 is expressed in a subset of the olfactory neurons localized in the olfactory epithelium, indicating that it may also have an as yet uncharacterized olfactory function

Modificación deuuna técnica para extracción de adn de glóbulos blancos humanos / Modification of a dna extraction technique from white human blood cells

Introducción: Las técnicas modificadas de extracción de ADN a partir de glóbulos blancos, permiten obtener un buen rendimiento en cantidad y pureza de ADN extraído. Objetivo: Modificar la técnica de extracción de ADN para economizar tiempo y reactivos utilizados. Materiales y Métodos: Fueron modificados los pasos de la técnica de extracción de Gustafson (1987). La cantidad de ADN producida fue calculada por espectrofotometría. La pureza del ADN extraído fue evaluada mediante amplificación con PCR y comprobación en geles de agarosa. Resultados: Las modificaciones que proponemos al método de Gustafson (1987) representan un ahorro económico del 70% y en tiempo de 6 horas aproximadamente. Conclusión: El método que se propone en el presente trabajo es más económico en tiempo y dinero para la extracción de ADN de glóbulos blancos. Además, el rendimiento en cuanto a la cantidad de ADN producida es superior.

Introduction: The modified techniques for DNA extraction from white blood cells, allow obtaining a good efficiency in the extracted DNA quantity and purity. Objective: To modify the DNA extraction technique in order to save time and necessary reactives. Materials and Methods: Gustafson's /1987) extraction technique steps were modified. The quantity of DNA produced was calculated using spectrophotometry. The DNA purity was assessed through PCR amplification and confirmed using agarose gels. Results: The changes proposed to Gustafson's DNA extraction method, represent 70% savings in money, and a 6 hours savings in time approximately. Conclusion: The method proposed in the present work is more economic in time and money for white blood cells DNA extraction. Also the efficiency as far as quantity of DNA produced is higher.

Utilização de ácidos nucleicos fetais livres no plasma materno para o diagnóstico pré-natal: realidade do Brasil neste cenário / Use of cell-free fetal nucleic acids in maternal blood for prenatal diagnosis: the reality of this scenario in Brazil

A descoberta de ácidos nucleicos fetais livres no plasma de gestantes possibilitou o desenvolvimento de novos testes de diagnóstico pré-natal não invasivo para a determinação do sexo e do Rh fetal. Esses testes foram implantados no sistema de saúde pública de diversos países da Europa há mais de cinco anos. As novas possibilidades de aplicação diagnóstica dessas tecnologias são a detecção de aneuploidias cromossômicas fetais, de doenças monogênicas fetais e de distúrbios relacionados com a placenta, temas pesquisados intensivamente por diversos grupos ao redor do mundo. O objetivo deste estudo é expor a situação brasileira no âmbito de pesquisa e utilização clínica dos testes disponíveis comercialmente que utilizam esses marcadores moleculares plasmáticos, ressaltando as vantagens, tanto econômicas quanto de segurança, que os testes não invasivos têm em relação aos atualmente utilizados em nosso sistema de saúde pública.

The discovery of cell-free fetal nucleic acids in the plasma of pregnant women has allowed the development of new, noninvasive prenatal diagnostic tests for the determination of fetal gender and Rh. These tests have been implemented in the public health system in several countries of Europe for over five years. The new possibilities for diagnostic use of these technologies are the detection of fetal chromosomal aneuploidies, monogenic fetal disorders, and placental-related disorders, subjects that have been intensively studied by several groups around the world. The aim of this review was to assess the Brazilian research and clinical scenarios regarding the utilization of commercially available tests that use these plasma markers, stressing the advantages, both economic and safety-related, that non-invasive tests have when compared to those currently used in the Brazilian public health system.

Aptámeros: agentes diagnósticos y terapéuticos / Aptamers: diagnostic and therapeutic agents

Los aptámeros son ácidos nucleicos de cadena sencilla, ADN o ARN, que reconocen una gran variedad de moléculas. Cada aptámero posee una estructura tridimensional particular que le permite unirse con afinidad y especificidad altas a la molécula diana. Los aptámeros tienen propiedades de reconocimiento equiparables a las de los anticuerpos; sin embargo, por la naturaleza de su composición tienen ventajas significativas en cuanto a su tamaño, producción y modificación. Estas características los hacen excelentes candidatos para el desarrollo de nuevas plataformas biotecnológicas. Se han identificado aptámeros con propiedades terapéuticas que han sido evaluados exitosamente en modelos animales; entre ellos, algunos se encuentran en fase clínica y uno ya fue aprobado para tratamiento por la FDA (Food and Drug Administration). Todos estos avances ocurridos durante las dos últimas décadas permiten anticipar el protagonismo que tendrán los aptámeros como agentes diagnósticos y terapéuticos en un futuro cercano.

Aptamers are single-stranded DNA or RNA molecules that recognize a variety of target molecules with high levels of affinity and specificity, due to their particular three-dimensional structure. They are similar to antibodies regarding the recognition process. However, they offer significant advantages over antibodies based on their size, ease of production and various chemical modifications. Thus, they are excellent candidates for developing new biotechnological platforms. Up to date, several aptamers with therapeutic properties have been successfully evaluated in animal models and clinical trials. Moreover, one of them has already been approved by the FDA. Advances during the last two decades allow to foresee that aptamers will play a key role as diagnostic and therapeutic agents in the near future.

Evaluación de dss métodos de extracción de adn partir de biopsias fijadas en forMalina y embebidas en parafina en condiciones no pttimas / Evaluation of Two Methods DNA Extraction from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues on Non-Optimal Conditions

Los tejidos de archivo son material de incalculable valor para estudios retrospectivos que requieran la aplicación de análisis moleculares. Existen múltiples métodos de extracción de ADN a partir de este tipo de muestras. No obstante, la mayoría de métodos toman mucho tiempo y los reactivos empleados contribuyen a la fragmentación del ADN. Con el objetivo de optimizar dos métodos de extracción de ADN a partir de tejidos embebidos en parafina en condiciones no óptimas, se seleccionaron 47 bloques en parafina que contenían biopsias de pleura, pulmón y pericardio correspondientes a 24 pacientes (66,6% hombres) mayores de 18 años, con inflamación granulomatosa crónica, remitidos al Departamento de Patología, Hospital Universitario del Valle entre 2002 y 2007. Se realizaron 10 cortes a cada muestra y se sometieron a dos métodos de extracción de ADN: 1. convencional y 2. QIAamp-DNA mini kit®. La eficiencia del ADN fue valorada por espectrofotometría y amplificación del gen GAPDH. La concentración de ADN de las muestras extraídas por el método convencional fue de 65,52 ng/µL ±11,47 (promedio ± EE) y la relación 260/280 varió entre 0,52 y 2,30. De las muestras extraídas por el método comercial, la concentración media de ADN fue 60,89 ng/µL ± 6,02, con una absorbancia que osciló entre 0 y 2,64. El ADN obtenido fue sometido a PCR, de 47 muestras extraídas por ambos métodos, 25 y 23 respectivamente amplificaron exitosamente el gen GAPDH. Los métodos usados para la obtención de ADN presentaron un desempeño similar, revelando así su potencial utilidad en estudios retrospectivos a partir de biopsias embebidas en parafina en condiciones inadecuadas.

Paraffin wax embedded tissues are an invaluable material for retrospective studies requiring the application of molecular analysis. Multiple methods are available to extract DNA from these kind of samples. However, the most common methods are slow and the reagents often contribute to the fragmentation of genetic material. In order to optimize the procedure, two methods for DNA extraction from paraffin embedded tissue non-optimal conditions were used. 47 blocks containing paraffin-embedded biopsies of pleura, lung and pericardium from 24 patients (66.6% males) older than 18 years, with biopsy proven chronic granulomatous inflammation referred to the Department of Pathology at University hospital of Valle between 2002 and 2007 were selected. Each sample was subjected to 10 cuts and was to two methods of DNA extraction: 1. conventional and 2. QIAamp-DNA mini kit®. The efficiency of the extracted DNA, was assessed by spectrophotometry and PCR amplification of a fragment of the housekeeping gene GAPDH. The concentration of DNA samples extracted by the conventional method was of 65.52 ng/µL ± 11.47 (mean ± SE) and the 260/280 absorbance ratio ranged between 0.52 and 2.30 the average concentration of DNA of the samples extracted by the commercial method was 60.89 ng/µL ± 6.02 (mean ± SE), with an absorbance that fluctuated between 0 and 2.64. The DNA obtained was amplified by PCR, of 47 samples extracted by both methods, 25 and 23 respectively the GAPDH gene amplified successfully. The methods used to obtain DNA showed similar performance, highlighting the potential utility of both extraction methods for the retrospective studies from paraffin embedded tissues in unsuitable conditions.

Técnicas de quantificação da síntese microbiana no rúmen: uma revisão / Quantification techniques of the protein microbial synthesis in rumen: a review / Técnicas de cuantificación de síntesis microbiana en rumen: una revisión

Quantificar a síntese de proteína microbiana em animais ruminantes é de grande importância para avaliar a qualidade nutritiva das dietas. A determinação dessa síntese se obtém por meio da utilização de marcadores microbianos, osquais são classificados em internos (subprodutos dos microrganismos ruminais) e externos (produtos administrados aos animais que são incorporados pelos microrganismos) e técnicas indiretas. Embora tenham ocorrido avanços ainda não se tem o marcador ideal. O objetivo desta revisão é detalhar a cada uma das vantagens e desvantagens das técnicas para estimar a síntese de proteína microbiana no rúmen e discutir os resultados obtidos utilizando cadatécnica.

The quantification of the microbial protein synthesis in the ruminants is of great importance to assess the nutritional quality of the diets. The determination of microbial synthesis is achieved through the use of microbial markers, which are classified: internal (by-products of rumen microorganisms) and external (substances administeredto animals that are incorporated by rumen microorganisms). Although some advances has occurred lately anideal marker still need to be developed. So the objective of this review is to detail each of the techniques forestimating microbial protein synthesis in the rumen, and discuss the results obtained using each technique.

La cuantificación de la síntesis de proteína microbiana en los rumiantes es de gran importancia para evaluar lacalidad nutricional de las dietas. La determinación de la síntesis microbiana se logra a través del uso de marcadoresmicrobianos que se clasifican como: Internos (subproductos de los organismos de la panza) y externos (sustancias administradas a los animales que son incorporadas por los organismos de la panza). Aunque últimamente ha habido algunos avances, aún es necesario desarrollar un marcador ideal. Así que el objetivo de esta revisión es detallarcada una de las técnicas usadas para estimar la síntesis de proteína microbiana en la panza y discutir los resultados obtenidos al usar cada técnica.